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UV1901PC紫外可見分光光度計檢測蛋白質的方法

紫外可見分光光度計簡介：

隨著現(xiàn)代科技的不斷發(fā)展和進步，現(xiàn)代分光光度的測試手段和方法都在不斷改進，但zui根本的依據(jù)仍然建立在朗伯-比爾定律的基礎之上。

A=KLC

式中：

A-為被測物在給定波長的需光吸光度值

     K-為一系數(shù)，稱為溶液的吸收系數(shù)（與入射光波長及被測物質的特性有關）

     L-為被測物質的厚度（一般與比色池的厚度有關）

     C-為被測物質的濃度

    由上式可以看出，被測物質對單色光的吸光度與被測物質的濃度成正比。

實際測試時，單色光通過被測物質達到光電接收器中，由光電倍增管或光電池轉換成光電流，而光電流的強弱決定了吸光度值A的大小。假定通過參比樣品的光電流為I。，而通過待測樣品的光電流為I，則兩者之比設定為τ，也稱透射比（或以T%表示，稱為透過率）。則：

τ=I/ IO×100%

朗伯-比爾定律的貢獻就是發(fā)現(xiàn)了透射比的負對數(shù)值（也就是吸光度A）的變化與物質的濃度的變化呈正比關系。即：

A=-lgτ或lg（IO/I）=KCL

    同時，不同的物質對不同波長的單色光呈現(xiàn)出不同的吸光度值，這一變化特征也就是分光光度法用于物質的定性定量分析的理論基礎。

基于上述原理，就可以知道無論是以往的儀器還是現(xiàn)在的儀器，其zui基本的工作要求都是能準確獲得物質（或稱樣品）在某一波長的透射比或在某一個光譜波長范圍的吸光度變化特性（具體說光譜特性譜圖）。而UV1901PC/UV1902PC雙光束紫外可見分光光度計，能同時測量參比樣品和待測樣品。由于參比樣品和待測樣品是同時測量的，所以任何由光源帶來的影響都被抵消了，從方法上保證了測量度。

UV1901PC紫外可見分光光度計檢測蛋白質的原理：

根據(jù)朗伯－比耳定律：A=εbc，當入射光波長λ及光程b一定時，在一定濃度范圍內，有色物質的吸光度A與該物質的濃度c成正比.

蛋白質可作定量分析的原因：蛋白質中酪氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，所以蛋白質溶液在275—280nm具有一個吸收紫外吸收高峰。在一定濃度范圍內，蛋白質溶液在zui大吸收波長處的吸光度與其濃度成正比，服從朗伯-比耳定律，因此可作定量分析。該法測定蛋白質的濃度范圍為0.1—1.0mg/mL。

有嘌呤、嘧啶等核酸類干擾時的經(jīng)驗公式：若樣品中含有嘌呤、嘧啶等核酸類吸收紫外光的物質，在280nm處來測量蛋白質含量時，會有較大的干擾。核酸在260nm處的光吸收比280nm更強，但蛋白質卻恰恰相反，因此可利用280nm及260nm的吸收差來計算蛋白質的含量。常用下列經(jīng)驗公式計算： 

蛋白質濃度（mg/mL）=1.4280-0.74A260  

(A280和A260分別為蛋白質溶液在280nm和260nm處測得的吸光度值) 還可以通過下述經(jīng)驗公式直接計算出溶液中的蛋白質的含量： 蛋白質濃度（mg/mL）=F* A280*D*1/d 

其中A280為蛋白質溶液在280nm處測得的吸光度值；d為石英比色皿的厚度（cm）;D為溶液的稀釋倍數(shù)；F為校正因子 

（4）稀溶液中蛋白質濃度測定的經(jīng)驗公式：蛋白質的肽鍵在200—250nm有強的紫外吸收。其光吸收強度在一定范圍與濃度成正比，其波長越短，光吸收越強。若選用215nm可減少干擾及光散射，用215nm和225nm光吸收差值與單一波長測定相比，可減少非蛋白質成分引起的誤差，因此，對稀溶液中蛋白質濃度測定，可選用215nm和225nm光吸收差法。常用下列經(jīng)驗公式： 

蛋白質濃度（mg/mL）=0.144（A215-A225） 

（A215和A225分別為蛋白質溶液在215nm和225nm處測得的吸光度值。

儀器與試劑 

儀器：uv-1901pc紫外-可見分光光度計

UV1901PC紫外可見分光光度計特點：

采用濱松無臭氧環(huán)保型氘燈，普通長壽命氘燈會有臭氧產(chǎn)生，長期吸入對身體有害，無臭氧長壽命氘燈就可以有效避免。儀器還采用德國歐士朗鎢燈，美國派來芝檢測器，雙光束光學系統(tǒng)，加厚光學底板，更能保證儀器的穩(wěn)定性。操作界面和操作系統(tǒng)都是簡便快捷版的，減少了檢測時間的同時，增加準確性.吸光度可以到小數(shù)點后四位。可選配多種附件，自動四聯(lián)池，七聯(lián)池，恒溫裝置，透過率固體架，反射率固體架等。

比色管（10ml的5個），吸量管。 試劑：標準蛋白質溶液：5.00 mg/mL溶液、0.9% NaCl溶液，待測蛋白質溶液（牛血清白蛋白）。

實驗過程：

啟動計算機，打開主機電源開關，啟動工作站并初始化儀器,預熱半小時。 

用吸量管分別吸取0.6、0.8、1.0、1.2、1.4mL 5.00 mg/mL標準蛋白質溶液于5只10 mL 比色管中，用0.9% NaCl溶液稀釋至刻度，搖勻。用1 cm石英比色皿，以0.9%NaCl溶液為參比（參比溶液不可取出）. 

在工作界面上選擇測量項目為光譜掃描，設置掃描參數(shù)（起點：400nm，終點：250nm，速度：中，間隔：1.0nm，單次掃描） 

將兩個均裝有0.9%NaCl溶液的1cm石英比色皿放入測量池中，進行基線掃描，然后選定量測定，校零，在調回光譜掃描。 

附加：吸收曲線的制作:（找出zui大吸收波長） 

將放在前面的比色皿中溶液換為0.3 mg/mL的蛋白質溶液，點擊START進行掃描，得到如下吸收曲線，從曲線中我們可以看出此標準蛋白質溶液的zui大吸收波長為278nm，此波長下的吸光度為   。  

標準曲線的制作： 

在工作界面上選擇測量項目為光度測量設置測量條件（測量波長：278.00 nm）。 

用1 cm石英比色皿，以0.9%NaCl溶液為參比，在278nm處分別測定以上所配標準溶液的吸光度A278，以蛋白質濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線：

樣品測定： 

配制三份待測蛋白質溶液，（取待測蛋白質溶液2.0mL分別于3只10mL 比色管中，用0.9% NaCl溶液稀釋至刻度）按上述方法測定278 nm處的吸光度。得吸光度依次為0.3906，0.3765，0.3848。平均值為A278=0.3840,根據(jù)樣品溶液的吸光度，從標準曲線上查出待測蛋白質的濃度為0.6101mg/mL。轉換后待測蛋白質溶液的濃度為C= 0.6101mg/mL •10 mL /2.0mL=3.0505mg/mL。